Spuriously transcribed RNAs from CRISPR-sgRNA expression plasmids scaffold biomolecular condensate formation and hamper accurate genomic imaging

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf192

 

요약

 

1. CRISPR sgRNA 발현 플라스미드에서 유래한 비의도적 전사체가 응축체 형성에 관여: sgRNA 발현용 플라스미드에서 예상치 않게 생성된 RNA(cryptic transcripts)가 RNA-binding 단백질(FUS, SFPQ, PSPC1)과 상호작용하여 위양성 핵 내 응축체를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이는 실제 타깃 위치가 아님에도 형광 시각화 신호를 생성하여 유전체 이미징의 정확도를 저해합니다.
2. 이러한 위양성 응축체는 sgRNA scaffold 설계와 무관하게 발생: 원래 sgRNA 설계나 표지 방식(RNA aptamer 또는 molecular beacon)과 무관하게, 해당 현상은 플라스미드 기반 sgRNA 발현 방식 자체에서 유래한 문제로 확인되었습니다.
3. 이 응축체는 액체처럼 융합하며, 1,6-헥산디올 처리에 민감: 이들 핵 내 응축체는 액체-액체 상분리(LLPS)의 전형적 특성인 구형성, 융합 능력, 1,6-hexanediol에 의한 해체 반응을 보이며, 이는 생체 응축체의 전형적인 물리적 특성입니다.
4. 플라스미드 대신 sgRNA 발현 카세트(transcription unit)만을 도입하면 위양성 신호 억제 가능: 플라스미드 백본을 제거하고 U6-sgRNA 발현 카세트만 도입하면 위양성 응축체 형성이 거의 발생하지 않았으며, 정확한 유전체 위치 표지가 가능해졌습니다.
5. CRISPR 이미징 기술의 정밀도를 높이기 위한 새로운 전략 제안: 본 연구는 sgRNA 발현 시스템에서 생기는 비의도적 전사체에 의한 오작동을 체계적으로 규명하였고, 유전체 이미징에서 위양성 신호를 억제하기 위한 실질적인 개선 방법을 제시했습니다.

 

Abstract

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based imaging tools that utilize fluorescently tagged single-guide RNAs (sgRNAs) have enabled versatile analysis of the dynamics of single genomic loci, but the accuracy may be hindered by nonspecific subnuclear probe accumulation, generating false-positive foci in cell nuclei. By examining the subcellular localizations of sgRNA expression plasmids, their RNA transcripts, and several RNA-binding proteins, we found that spuriously transcribed (cryptic) transcripts, produced by sgRNA expression plasmids, are the major contributors of false-positive signals, independent of sgRNA scaffold design or effector probe (i.e. RNA aptamer- or oligonucleotide-based probes) used. These transcripts interact with the paraspeckle core proteins, but not with the sgRNA expression plasmids or the paraspeckle RNA scaffold NEAT1_2, to form nuclear bodies that display liquid-like properties including sphericality, fusion competence, and sensitivity to 1,6-hexanediol. Transfecting sgRNA transcription units (i.e. sgRNA expression cassettes), lacking the plasmid backbones, reduces false-positive signals and enhances genomic imaging accuracy. Overall, this study unveils previously undescribed activities of cryptic plasmid transcripts and presents an easy-to-adapt strategy that can potentially improve the precision of CRISPR-based imaging systems that implement fluorescently tagged sgRNAs.