Liquid–Liquid Phase Separation of Supercharged Green Fluorescence Proteins in the Polyamine Biosynthetic Pathway Deleted E. coli

https://doi.org/10.1002/cbic.202400966

요약

 

1. 슈퍼차지드 GFP를 이용한 LLPS 연구: 저자들은 양전하(+28) 및 음전하(–27)를 띠는 supercharged green fluorescent proteins (GFP)를 사용하여 액-액 상분리(Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS) 현상을 연구하였습니다.
2. 폴리아민 생합성 경로가 결핍된 E. coli HT873 균주 사용: 폴리아민(polyamine)의 영향을 명확히 파악하기 위해 폴리아민 생합성 경로가 제거된 E. coli HT873 균주를 사용하였습니다. 이를 통해 내인성 폴리아민이 없는 조건에서 ATP와 폴리아민의 역할을 평가하였습니다.
3. ATP와 폴리아민이 LLPS에 미치는 영향: ATP는 양전하 GFP(+28)의 LLPS를 유도하는 역할을 하였으며, ATP 감소(CCCP 처리) 시 상분리가 감소했습니다. 반면, 음전하 GFP(–27)는 ATP 존재 시 분산되어 있었고, ATP 감소 시 LLPS가 증가하였습니다. 특히 폴리아민을 첨가하면 음전하 GFP(–27)에서 강한 LLPS가 유도되었고, 양전하 GFP(+28)에서는 폴리아민이 ATP 작용을 방해하며 상분리를 억제하는 역할을 했습니다. 이를 통해 ATP와 폴리아민이 각각 단백질 전하에 따라 LLPS를 조절함을 확인했습니다.
4. 이미지 분석 및 상호작용 평가: Poly-YOLO라는 딥러닝 기반 이미지 분석 도구를 사용해 객관적인 세포 내 상분리 비율을 분석하였고, GFP와 폴리아민의 공간적 상호작용을 교차 상관 분석을 통해 확인하였습니다. 특히 음전하 GFP(–27)와 폴리아민은 높은 공위치성(Pearson 상관계수 0.91)을 보였습니다.
5. 세포 내 LLPS 조절 메커니즘: 이 연구는 ATP와 폴리아민이 각각 양전하와 음전하 단백질의 LLPS를 조절하는 주요 생체 내 소분자임을 보여주었고, 이를 통해 세포 내 단백질 응집체 형성 메커니즘과 신경퇴행성 질환과의 연관성에 대한 이해를 심화시켰습니다.

 

 

Abstract

Protein liquid–liquid phase separation (LLPS) has attracted significant attention due to its involvement in cellular functions and has been believed to be the onset of neurodegenerative diseases. However, the primary mechanisms governing its formation and function remain unclear. Since most of proteins involved in condensation in cells are charged, it is hypothesized that charge–charge interactions mediated by small charged biomolecules, such as adenosine tri-phosphate (ATP) and polyamines, would be the primary driving force behind the protein LLPS. In the previous study, it is showed that small charged biomolecules are to be a main driver of protein LLPS through charge–charge interaction. Furthermore, multivalently charged small molecules play a crucial role in creating protein condensates when the protein themselves are charged, effectively acting as bridges between charged proteins. Having said that, the effect of endogenous polyamine molecules in protein condensation in cells could not be ruled out. In this study, an E. coli strain is utilized with a polyamine synthetase knocked-down, HT873, to investigate the role of polyamines in the aggregation of both negatively and positively charged green fluorescence proteins. This study suggests that both ATP and polyamine, as small charged biomolecules, play critical roles in the LLPS of charged proteins in cells.