https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.5c00262
요약
- FUS condensate의 액-액 상분리(LLPS) 및 액체-고체 전이(Liquid-to-Solid Transition) 과정 연구: 본 연구에서는 FUS 단백질을 모델로 사용하여 LLPS 및 액체-고체 전이 과정을 형광 단백질의 fluorescence lifetime을 이용해 비파괴적으로 추적하였습니다. 이 방법은 기존 FRAP보다 더 실시간으로 fluidity 변화를 감지할 수 있습니다.
- fluorescence lifetime을 이용한 condensate fluidity 평가: Superfolder GFP를 FUS에 융합하여 fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)으로 LLPS 및 액체-고체 전이에 따른 fluorescence lifetime 변화를 측정하였으며, fluorescence lifetime 감소가 condensate의 fluidity 감소를 나타냄을 확인하였습니다.
- FUS G156E 변이체를 통한 병리적 응집체 특성 확인: ALS 관련 변이체인 FUS-G156E는 액체-고체 전이를 가속화하였고, FLIM을 통해 중앙부와 섬유 구조(fiber)의 fluorescence lifetime 차이를 확인하여 병리적 응집체의 내부 구조 차이를 시각화할 수 있음을 보여주었습니다.
- 여러 형광 단백질의 lifetime 민감도 비교 및 key residue 규명: 다양한 형광 단백질(GFP, mCherry, mVenus 등)의 LLPS 및 액체-고체 전이에 대한 lifetime 변화 민감도를 비교하였고, mEYFP는 상대적으로 민감도가 낮았지만 특정 아미노산 변이를 통해 민감도를 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이로써 fluorescence lifetime 민감도를 조절할 수 있는 key residue (47, 154, 164, 176)를 규명하였습니다.
- FLIM을 이용한 살아있는 세포 내 optoFUS 전이 모니터링: 빛으로 조절되는 optoFUS 시스템을 HEK293T 세포에 도입하여, blue light에 의해 유도되는 LLPS 및 액체-고체 전이 과정을 FLIM으로 실시간 추적하였습니다. 이를 통해 형광 단백질의 lifetime 감소가 condensate의 fluidity 감소 및 크기 증가와 관련됨을 입증하였습니다.
Abstarct
Liquid–liquid phase separation (LLPS) of biomolecules is a fundamental cellular process that is essential for maintaining homeostasis and facilitating biochemical activities. On the other hand, aberrant phase separation alters condensate fluidity and causes a transition from liquid-like condensates to solid-like condensates, which may lead to the formation of the pathological aggregations often observed in neurodegenerative diseases. Condensate fluidity is usually assessed by the fluorescence recovery after photobleaching. Here, we reveal that the fluorescence lifetimes of several fluorescent proteins are sensitive to LLPS and the liquid-to-solid transition. Furthermore, we identify several key residues that regulate the sensitivity of fluorescence lifetimes toward phase separation. Thus, we apply fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to visualize LLPS and the liquid-to-solid transition in living cells, demonstrating that FLIM is a nondestructive method for tracking changes in condensate fluidity in real time.