Mechanism of polymer molecular weight-dependent suppression and promotion of liquid–liquid phase separation of a protein solution by the addition of polymer

https://doi.org/10.1063/5.0245398

Abstract

Polyethylene glycol (PEG) is a widely used precipitant to concentrate proteins. The effect of PEG is generally understood to be an entropic attraction between proteins due to the depletion effect of PEG around proteins. However, measurements by Bloustine et al. [Phys. Rev. Lett. 96, 087803 (2006)] of the liquid–liquid phase separation (LLPS) temperature have shown that a lysozyme solution is stabilized and destabilized by the addition of low and high molecular-weight PEG, respectively. They also presented a theoretical model of the LLPS temperature as a virial expansion of the free energy and concluded that, in addition to the depletion effect, the attractive interaction between protein and PEG is necessary to explain the experiments. In the present study, theoretical calculations based on liquid-state density functional theory utilizing coarse-grained models are conducted to demonstrate that the protein–PEG effective attraction is responsible for the suppression and promotion of LLPS upon the addition of low- and high-weight PEG, respectively. In contrast, if the interactions between the protein and the PEG are solely due to the excluded volume effect, PEG of any molecular weight destabilizes the solution. These results suggest the necessity to reconsider the conventional understanding of the effects of polymer addition, which have been historically attributed to solely the depletion force.

 

요약

1. 고분자 첨가에 따른 단백질 용액의 상분리 조절 연구: 연구진은 고분자의 분자량에 따라 단백질 용액의 액-액 상분리(Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)를 억제하거나 촉진하는 메커니즘을 조사하였습니다. 일반적으로 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 단백질 용액에서 침전제로 작용하지만, 저분자량과 고분자량 PEG가 서로 다른 방식으로 LLPS에 영향을 미친다는 점이 밝혀졌습니다.
2. 저분자량 PEG의 LLPS 억제 효과: 저분자량 PEG를 첨가하면 단백질과의 약한 결합이 형성되어 단백질 간의 직접적인 응집을 방해하며, LLPS가 억제되었습니다. 이는 기존의 단순한 배제 효과(excluded volume effect)로는 설명할 수 없으며, 단백질-고분자 간의 약한 인력(attractive interaction)이 중요한 역할을 한다는 점이 확인되었습니다.
3. 고분자량 PEG의 LLPS 촉진 효과: 반대로, 고분자량 PEG는 단백질 간의 장거리 인력을 증가시켜 LLPS를 촉진하는 경향을 보였습니다. 특히, 고분자량 PEG는 단백질 주위에 흡착층(polymer adsorption layer)을 형성하며, 이는 단백질 간의 상호작용을 강화하여 응집을 유도하는 역할을 합니다.
4. 밀도 함수 이론(DFT) 기반 계산 연구: 연구진은 연속 매질(coarse-grained) 모델과 액체 상태 밀도 함수 이론(Liquid-State Density Functional Theory, DFT)을 활용하여 단백질-고분자 상호작용을 해석하였습니다. 이를 통해, PEG의 분자량에 따른 LLPS 조절 메커니즘을 정량적으로 분석하고, 단순한 배제 효과 이상의 인력이 작용한다는 것을 확인하였습니다.
5. 생물학 및 생명공학 응용 가능성: 본 연구는 단백질 용액에서 고분자 첨가가 LLPS를 조절하는 새로운 기작을 제시하며, 이는 단백질 결정화, 의약용 단백질 제형 개발, 생체내 응축체 형성 연구 등에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 고분자의 분자량을 조절하여 단백질 상분리를 원하는 방향으로 유도할 수 있는 전략이 제시되었습니다.