Amyloid forming human lysozyme intermediates are stabilised by non-native amide-π interactions

https://doi.org/10.1101/2024.12.20.629167

 

Abstract

Mutational variants of human lysozyme cause a rare but fatal hereditary form of systemic amyloidosis by populating an intermediate state that self-assembles into amyloid fibrils. Despite its significance in lysozyme amyloidosis, the intermediate state has been recalcitrant to detailed structural investigation as it is only transiently and sparsely populated. Here, we investigated the intermediate state of a mutational variant of human lysozyme (I59T) using CEST and CPMG RD NMR at low pH. 15N CEST profiles probed the thermal unfolding of the native state into the denatured ensemble and revealed an additional state distinct from the two major states. Global fitting of 15N CEST and CPMG data provided kinetic and thermodynamic parameters for the exchange between all three states, characterising the intermediate state populated at 0.6%. 1H CEST data also confirmed the presence of the intermediate state displaying unusually high or low 1HN chemical shifts. To further investigate the structural details of the intermediate state we used molecular dynamics (MD) simulations, which recapitulated the experimentally observed folding pathway and free energy landscape. A high-energy intermediate state with a locally disordered β-domain and C-helix was observed, revealing non-native hydrogen bonding and amide-π interactions. These interactions account for the anomalous 1H chemical shifts and likely stabilise the transient intermediate state structure. Together, our NMR and MD data provide the first direct structural information on the intermediate state, offering insights into targeting lysozyme amyloidosis.

 

요약

 

 

1. 아밀로이드 형성 중간체 구조 규명: 인간 리소자임(Lysozyme)의 돌연변이 I59T는 pH 1.2에서 15N CEST 및 CPMG NMR 분석을 통해 아밀로이드 형성 중 일시적 중간체(intermediate state)를 형성하며, 이는 비정상적인 아마이드-π 상호작용(amide-π interactions)으로 안정화됩니다.
2. β-도메인과 C-헬릭스의 국소적 비구조화: NMR 및 MD 시뮬레이션 결과, 아밀로이드 형성 중에는 β-도메인과 C-헬릭스가 국소적으로 비구조화되며, 비정상 수소결합 및 π-상호작용이 이를 안정화시켜 병리적 응집체 형성을 유도합니다.
3. CEST와 CPMG로 세 가지 구조적 상태 분석: 네이티브(N), 중간체(I), 변성(D) 상태 간의 교환 과정이 분석되었으며, 중간체는 전체 단백질 중 0.6% 정도의 낮은 비율로 존재하지만, 아밀로이드 섬유 형성에는 결정적 역할을 합니다.
4. MD 시뮬레이션을 통한 접힘 경로 재현: Ratchet-and-pawl MD 시뮬레이션을 통해 접힘 경로를 분석한 결과, Trp, Tyr와의 아마이드-π 상호작용이 중간체의 구조적 안정성 및 화학적 시프트 변화를 유발한다는 것을 확인했습니다.
5. 병리적 시사점 및 치료 전략: 비정상적인 아마이드-π 상호작용이 아밀로이드 섬유 형성의 핵심으로 작용함을 밝혔으며, 이를 억제하기 위한 아로마틱 리간드 기반 약물 설계 전략의 가능성을 제시하였습니다.