https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2025.101029
요약
- GFP 태그는 HP1α의 상분리를 강하게 억제합니다: 대형 형광태그(GFP, mEGFP)를 HP1α 단백질에 부착하면 상분리 임계 농도가 75배 이상 증가하며, 상분리 형태 또한 비정상적(non-spherical)으로 나타납니다. 이는 태그 자체의 부피가 HP1α의 상호작용을 방해하고, 상분리 유도 능력을 억제함을 보여줍니다.
- 소형 태그인 UnaG는 HP1α 상분리를 거의 방해하지 않습니다: 13 kDa의 작은 형광 단백질 UnaG에 16-aa 길이의 GGS-rich linker를 연결한 구성은 상분리에 거의 영향을 주지 않았으며, 실제로 야생형 HP1α와 유사한 수준의 임계 농도에서 상분리를 유도하였습니다. FRAP 실험 결과에서도 이 구성이 seconds-scale의 회복 특성을 유지함을 확인했습니다.
- PEG8000 및 PEG4000은 HP1α 상분리를 인위적으로 유도합니다: PEG를 이용한 molecular crowding 환경에서는 상분리 능력이 없는 HP1α 돌연변이(CSDm)나 일반적으로 상분리하지 않는 MBP 같은 globular protein도 상분리를 유도받았습니다. 이는 PEG가 단백질-단백질 상호작용뿐 아니라 DNA 결합까지 변화시킬 수 있음을 의미합니다.
- PEG는 상분리 상태에서의 단백질 확산 속도를 현저히 감소시킵니다: PEG8000이 존재할 경우, 전체 droplet을 FRAP로 bleaching한 후 회복률은 단 12% 수준에 그쳤고, droplet 내에서의 단백질 교환 속도 역시 매우 느려졌습니다. 이는 PEG가 단순한 crowding agent 이상의 작용, 즉 phase 내 동역학을 변화시키는 활성 인자로 작용함을 시사합니다.
- UnaG는 in vivo에서도 HP1α의 기능을 방해하지 않으며 안정적입니다: U2OS 세포에 CRISPR knock-in 방식으로 16aa-UnaG 또는 eUnaG가 부착된 HP1α를 삽입한 결과, 세포 내에서도 이 단백질은 이질염색질과 공존하며 정상적인 puncta를 형성하였습니다. 또한 FRAP 결과는 in vitro 결과와 일치하며, 태그가 세포 내 상분리 특성에도 영향을 거의 주지 않음을 확인했습니다.
Abstract
The heterochromatin protein HP1α (heterochromatin protein 1 alpha) phase separates in vitro and displays properties compatible with phase separation in cells. Phase separation of HP1α in cells is typically studied using genetically encoded fluorescent tags such as green fluorescent protein (GFP). Whether such tags affect the intrinsic phase separation properties of HP1α is understudied. We assessed how tag size and linker length affect phase separation by HP1α in vitro. GFP tags inhibited phase separation by HP1α. In contrast, an UnaG tag with a 16 amino acid glycine-glycine-serine (GGS) linker minimally perturbed HP1α phase separation in vitro and could be used to visualize HP1α dynamics in cells. We further investigated the effects of a commonly used crowding agent, polyethylene glycol (PEG). PEG induced phase separation of proteins with no propensity to phase separate under physiological buffer conditions and dampened the effects of HP1α mutations. Therefore, phase separation of biological macromolecules with PEG-containing crowding agents should be interpreted with caution.